胆囊癌CD133阳性细胞侵袭机制的实验研究_中国普外基础与临床杂志

作者：

 俞远林 ^1,2 , 姜波健 ¹ , 陆瑞褀 ¹ , 王守练 ^1,2 ,  俞继卫 ¹

1. 上海交通大学医学院附属第三人民医院普外一科（上海 201900）;
2. 安徽省蚌埠医学院研究生部（安徽蚌埠 233030）;

关键词：

胆囊癌侵袭 CD133 SDF-1α/CXCR4

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摘要 全文 图表 视频 参考文献 施引文献

目的研究胆囊癌CD133阳性细胞侵袭能力的产生机制。方法 Transwell法检测CD133阳性细胞和CD133阴性细胞的迁移和侵袭能力。半定量聚合酶链式反应（RT-PCR）法、蛋白免疫印迹法、细胞免疫荧光法分别检测CD133阳性细胞和CD133阴性细胞中CXCR4的表达。分别用SDF-1α、AMD3100作用GBC-SD细胞后，Transwell法检测CD133阳性细胞和CD133阴性细胞的迁移和侵袭能力。半定量RT-PCR法检测GBC-SD细胞中CD133 mRNA表达，蛋白免疫印迹法检测GBC-SD细胞中CD133蛋白表达。结果 ①CD133阳性细胞中穿膜细胞数明显多于CD133阴性细胞（23.78±8.74比6.56±3.09，P=0.000 7）。②CD133阳性细胞中CXCR4mRNA相对灰度值明显高于CD133阴性细胞（0.642 4±0.020 4比0.335 9±0.043 2，P=0.004）；CD133阳性细胞中CXCR4蛋白表达相对灰度值明显高于CD133阴性细胞（0.765 0±0.106 6比0.409 4±0.019 5，P=0.013）；CD133阳性细胞中CXCR4荧光蛋白表达明显强于CD133阴性细胞。③细胞侵袭能力：穿膜细胞数量在CD133阳性细胞中，与空白对照组（23.78±8.74）相比，SDF-1α组（62.89±15.27）明显增加（P=0.000 6），AMD3100组（10.33±2.00）明显减少（P=0.000 2）；在CD133阴性细胞中，与空白对照组（6.59±3.09）相比，SDF-1α组（6.89±4.23）无明显变化（P=0.41），AMD3100组（6.11±2.67）亦无明显变化（P=0.38）。④细胞迁移能力：迁移细胞数量，在CD133阳性细胞中，与空白对照组（35.56±10.97）相比，SDF-1α组（74.56±15.80）明显增加（P=0.000 3），AMD3100组（12.67±2.40）明显减少（P=0.000 2）；在CD133阴性细胞中，与空白对照组（9.56±1.74）相比，SDF-1α组（9.78±2.04）无明显变化（P=0.43），AMD3100组（9.54±1.74）亦无明显变化（P=0.42）。⑤在GBC-SD细胞中CD133 mRNA表达：与空白对照组（0.450 0±0.024 3）相比，SDF-1α组明显增加（0.626 5±0.048 7，P=0.004），AMD3100组（0.359 3±0.047 3）明显下降（P=0.011）；CD133蛋白表达：与空白对照组（0.440 9±0.013 0）相比，SDF-1α组（0.508 9±0.020 7）明显增加（P=0.016），而AMD3100组（0.317 7±0.013 7）明显下降（P=0.004）。结论胆囊癌CD133阳性细胞高侵袭能力可能由于高表达CXCR4。

引用本文： 俞远林, 姜波健, 陆瑞褀, 王守练, 俞继卫. 胆囊癌CD133阳性细胞侵袭机制的实验研究. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(2): 156-161. doi: 10.7507/1007-9424.20140036 复制

胆囊癌为胆管系统最常见的恶性肿瘤，其恶性程度高，转移快，因而预后极差^[1]。近年来发现，肿瘤起始细胞（tumor initiating cells，TICs）被认为是肿瘤发生、发展及转移的根源^[2]。本课题组^[3]的前期实验发现，胆囊癌CD133阳性细胞具有TICs部分特征。肿瘤侵袭是肿瘤转移的关键环节，胆囊癌血行转移极快，因而探索胆囊癌侵袭能力尤为必要。本研究旨在探究胆囊癌CD133阳性细胞的侵袭能力及其产生机制。

1 材料和方法

1.1 细胞和主要实验试剂

RENDANNANGAIXIBAOZHUGBC-SD，ZHONGGUOKEXUEYUANSHANGHAIXIBAOSHENGWUXUEYANJIUSUO，ZHONGGUO。TAINIUXUEQING，HyclonebbinXINTIYUYOUXUAN，MEIGUO；DMEMPEIYANGJI，JINUOSHENGWUYIYAOKEJIYOUXIANbbinXINTIYUYOUXUAN，ZHONGGUO。SHANYANGKANGXIAOSHUFITCBIAOJIDEYINGGUANGERKANG，BEIJINGDINGGUOSHENGWUYOUXIANZERENbbinXINTIYUYOUXUAN，ZHONGGUO。CXCR4TUKANGRENDUOKELONGKANGTI，AbcambbinXINTIYUYOUXUAN，YINGGUO。CD133FENXUANSHIJIHE、CD133SHUKANGRENDANKELONGKANGTI，MiltenyibbinXINTIYUYOUXUAN，DEGUO。LAGENGUOYANGHUAWUMEI（HRP）BIAOJIDEERKANG，JacksonbbinXINTIYUYOUXUAN，MEIGUO。RENZHONGZUJIZHIXIBAOYUANXINGYINZI-1α（SDF-1α），PeproTechbbinXINTIYUYOUXUAN，MEIGUO。AMD3100，SigmabbinXINTIYUYOUXUAN，MEIGUO。TrizolSHIJIHEPCRSHIJIHE，TakarabbinXINTIYUYOUXUAN，RIBEN。CXCR4YINWUHECD133YINWU，SHANGHAISHENGGONGSHENGWUGONGCHENGJISHUFUWUYOUXIANbbinXINTIYUYOUXUAN，ZHONGGUO。

1.2 细胞培养、免疫磁珠分选及实验分组

胆囊癌GBC-SD细胞分别放于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM和RPMI1640培养基中，置37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱中，每2～3 d传代1次。收集传代3～5次的GBC-SD细胞，调整细胞密度至1×10⁷个/mL，用300μL缓冲液重悬，按操作步骤经MiniMACS分离柱分选，用无血清含20 ng/mL EGF及10 ng/mL bFGF的DMEM重悬，分选出CD133阳性细胞及CD133阴性细胞。实验分为3组：①空白对照组，不加任何药物的GBC-SD细胞；②SDF-1α组，100 ng/mL SDF-1α刺激细胞2 h；③AMD3100组，CXCR4特异性抑制剂AMD3100（40μmol/L）预处理细胞30 min ^[4]。

1.3 三种方法检测CD133阳性细胞和CD133阴性细胞中CXCR4的表达

1.3.1 细胞免疫荧光法

取对数生长期的GBC-SD细胞接种于24孔板，每孔细胞数5×10⁴个，4%冰多聚甲醛固定20 min，1% BSA封闭30 min，CD133鼠抗人单克隆抗体（1：11），4℃孵育过夜，加入山羊抗小鼠FITC标记的荧光二抗（1：200），采用DAPI行细胞核染色，PBS代替一抗作为阴性对照，置于荧光显微镜下观察CD133阳性细胞和CD133阴性细胞中CXCR4的表达。

1.3.2 免疫蛋白印迹法（Western blot）

用100μL裂解液作用于1×10⁵个胰酶消化后的GBC-SD细胞，冰上裂解30 min，获取该组细胞的蛋白，每次均取15μL上样量在10%分离胶、5%浓缩胶上面进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，经电转膜仪转至PVDF膜。然后用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，用5%脱脂奶粉稀释的兔抗人CXCR4抗体（1：1 000）及CD133鼠抗人单克隆抗体（1：200），4℃轻摇过夜，用吐温-20三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液（TBST）振洗，洗3次，每次10 min，分别加HRP标记的山羊抗兔（1：2 000）和山羊抗鼠IgG二抗（1：2 000），室温下孵育2 h，再用TBST振洗2次，每次10 min；去除吐温的TBST振洗1次，每次10 min。加增强化学发光（ECL）底物显色，曝光洗片。取胶片于扫描仪上获取图像，图像分析软件进行半定量分析，实验重复3次取平均值^[5]。

1.3.3 半定量聚合酶链式反应（RT-PCR）

Trizol法提取总RNA，取500 ng总RNA逆转录为cDNA，反应体系为42℃30 min，99℃5 min，5℃5 min，总量为10μL。行PCR反应，CXCR4上游引物为5′-ATCATCTTCTTAACTGGCATTGTG-3′，下游引物为5′-GCTGTAGAGGTTGACTGTGTA-G-3′，产物长度228 bp，退火温度为53℃；CD133上游引物为5′-TTACGGCACTCTTCACCT-3′，下游引物为5′-TAT-TCCACAAGCAGCAAA-3′，产物长度172 bp，退火温度为57℃；GAPDH作为内参，上游引物为5′-A-CGGATTTGGTCGTATTGGGCG-3′，下游引物为5′-CTCCTGGA AGATGGTGATGG-3′，产物长度197 bp，退火温度为55℃。取5μL CD133 PCR产物，2μL GAPDH PCR产物，2%琼脂糖凝胶电泳检测，并保存图像，应用凝胶成像系统及凝胶图像分析软件行半定量分析CD133和CXCR4产物与对应的GAPDH产物的灰度值。目的mRNA表达水平以目的mRNA扩增条带灰度值与GAPDH mRNA扩增条带灰度值比值表示，实验重复3次，取平均值^[5]。

1.4 Transwell小室检测GBC-SD细胞的侵袭能力

将基质胶以1：1比例用无血清DMEM培养液稀释后，取50μL铺于Transwell上室中，置于37℃培养箱中，待上室的基质胶凝结。收集对数生长期GBC-SD细胞，以无血清DMEM培养基重悬，取无血清DMEM培养基重悬的GBC-SD细胞100μL加入Transwell上室中，调整细胞浓度为（1～5）×10⁵个/孔，下室中加入含有20%胎牛血清的DMEM完全培养基，于37℃培养箱培养24 h后，取出Transwell小室，用棉签擦去上室中的基质胶及细胞，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，在显微镜下平移非重叠观察9个视野，计数其中的穿膜细胞数，并计算平均数，实验结果最终以平均穿膜细胞数表示细胞的侵袭能力。

1.5 Transwell小室检测GBC-SD细胞的迁移能力

收集各组对数生长期GBC-SD细胞，以无血清DMEM培养基重悬，取无血清DMEM培养基重悬的GBC-SD细胞100μL加入Transwell上室中，调整细胞浓度为（1～5）×10⁵个/孔，下室中加入含有20%胎牛血清的DMEM完全培养基，37℃培养箱培养24 h后，取出Transwell小室，用棉签擦去上室的细胞，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，在显微镜下平移非重叠观察9个视野，计数其中的穿膜细胞数，并计算平均数，实验结果最终以平均穿膜细胞数表示细胞的迁移能力。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 CD133阳性细胞和CD133阴性细胞的侵袭能力检测结果

CD133阳性细胞的穿膜细胞数为23.78±8.74，明显多于CD133阴性细胞的穿膜细胞数（6.56±3.09），差异有统计学意义（P=0.000 7）。

2.2 定位与定量检测CD133阳性细胞和CD133阴性细胞中CXCR4表达结果

①细胞免疫荧光法检测发现，CD133阳性细胞中CXCR4蛋白表达强于CD133阴性细胞，且CXCR4蛋白主要定位于细胞膜（图 1）。②RT-PCR法检测的定性结果见图 2A；半定量结果：CD133阳性细胞中CXCR4 mRNA相对灰度值为0.642 4±0.020 4，明显高于CD133阴性细胞的0.335 9±0.043 2（P=0.004）。③Western blot法检测的定性结果见图 2B；半定量结果：CD133阳性细胞中CXCR4蛋白相对灰度值为0.765 0±0.106 6，明显高于CD133阴性细胞的0.409 4±0.019 5（P=0.013）。

图1 CD133阳性细胞和CD133阴性细胞中CXCR4蛋白表达结果（免疫荧光法×200）。1A：CD133阳性细胞；1B：CD133阴性细胞 图 2 CD133阳性细胞和CD133阴性细胞CXCR4 mRNA和蛋白表达结果。2A：CXCR4 mRNA表达电泳图。1：Marker；2：CD133阳性细胞；3：CD133阴性细胞。2B：CXCR4蛋白表达条带图。1：CD133阳性细胞；2：CD133阴性细胞 Figure1. Results of CXCR4 protein in CD133 positive cells and CD133 negative cells (Immunofluorescence×200). 1A: CD133 positive cells; 1B: CD133 negative cells Figure 2 Results of CXCR4 mRNA and protein in CD133 positive cells and CD133 negative cells. 2A: Electrophoretogram expression of CXCR4 mRNA. 1: Marker; 2: CD133 positive cells; 3: CD133 negative cells. 2B: Histogram expression of CXCR4 protein. 1: CD133 positive cells; 2: CD133 negative cells

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2.3 SDF-1α、AMD3100处理后CD133阳性细胞和CD133阴性细胞的侵袭能力检测结果

Transwell法染色结果见图 3。在CD133阳性细胞中的穿膜细胞数：与空白对照组（23.78±8.74）相比，SDF-1α组（62.89±15.27）明显增加（P=0.000 6），AMD3100组（10.33±2.00）明显减少（P=0.000 2）；在CD133阴性细胞中的穿膜细胞数：与空白对照组（6.59±3.09）相比，SDF-1α组（6.89±4.23）无明显变化（P=0.41），AMD3100组（6.11±2.67）亦无明显变化（P=0.38）。

图3 Transwell法检测各组CD133阳性细胞和CD133阴性细胞的侵袭能力（倒置显微镜×200） 图 4 Transwell法检测各组CD133阳性细胞和CD133阴性细胞的迁移能力（倒置显微镜×200）。3A、4A：空白对照组的CD133阳性细胞；3B、4B：SDF-1α组的CD133阳性细胞；3C、4C：AMD3100组的CD133阳性细胞；3D、4D：空白对照组的CD133阴性细胞；3E、4E：SDF-1α组的CD133阴性细胞；3F、4F：AMD3100组的CD133阴性细胞 Figure3. Invasive abilities of CD133 positive cells and CD133 negative cells in each group by Transwell (Inverted microscope×200) Figure 4 Migration abilities of CD133 positive cells and CD133 negative cells in each group by Transwell (Inverted microscope×200). 3A and 4A:CD133 positive cells in control group; 3B and 4B:CD133 positive cells in SDF-1αgroup; 3C and 4C:CD133 positive cells in AMD3100 group; 3D and 4D: CD133 negative cells in control group; 3E and 4E:CD133 negative cells in SDF-1αgroup; 3F and 4F:CD133 negative cells in AMD3100 group

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2.4 SDF-1α、AMD3100处理后CD133阳性细胞和CD133阴性细胞的迁移能力检测结果

Transwell法染色结果见图 4。在CD133阳性细胞中，与空白对照组（35.56±10.97）相比，SDF-1α组（74.56±15.80）穿膜细胞数明显增加（P=0.000 3），AMD3100组（12.67±2.40）穿膜细胞数明显减少（P=0.000 2）；在CD133阴性细胞中，与空白对照组（9.56±1.74）相比，SDF-1α组（9.78±2.04）穿膜细胞数无明显变化（P=0.43），AMD3100组（9.54±1.74）穿膜细胞数亦无明显变化（P=0.42）。

2.5 SDF-1α、AMD3100处理后GBC-SD细胞中CD133 mRNA和CD133蛋白表达结果

①RT-PCR检测的定性结果见图 5A；半定量结果：与空白对照组（0.450 0±0.024 3）相比，SDF-1α组（0.626 5±0.048 7）的CD133 mRNA表达明显增加（P=0.004），AMD3100组（0.359 3±0.047 3）的CD133 mRNA表达明显下降（P=0.011）。②Western blot检测的定性结果见图 5B；半定量结果：与空白照组（0.440 9±0.013 0）相比，SDF-1α组（0.508 9±0.020 7）的CD133蛋白表达明显增加（P=0.016），而AMD3100组（0.317 7±0.013 7）的CD133蛋白表达明显下降（P=0.004）。

图5 各组GBC-SD细胞中CD133 mRNA和蛋白表达变化。5A：CD133 mRNA表达电泳图。1：Marker；2：空白对照组；3：SDF-1α组；4：AMD3100组。5B：CD133蛋白表达条带图。1：空白对照组；2：SDF-1α组；3：AMD3100组 Figure5. CD133 mRNA and protein expressions in GBC-SD cells. 5A: Electrophoretogram expression of CD133 mRNA. 1: Marker; 2: Control group; 3: SDF-1αgroup; 4: AMD3100 group. 5B: Histogram expression of CD133 protein. 1: Control group; 2: SDF-1αgroup; 3: AMD3100 group

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3 讨论

肿瘤发生大致有两种解释模型，一种是传统的随机模型，另一种是TICs模型。有别于随机模型，TICs模型认为肿瘤是内部呈现异质性的等级结构，然而决定肿瘤无限增殖、自我更新及多向分化的关键仅为其中的一部分细胞即TICs。同时，TICs在启动肿瘤侵袭和转移过程中发挥着至关重要的作用^[2]。

CD133是一种5次跨膜蛋白，起初作为造血干细胞的标志物。近年来发现，CD133已经作为TICs的表面标志物在多种实体肿瘤中得到论证^[6-9]。基于本课题组^[3]的前期实验，bbin新体育优选从胆囊癌中成功分离出CD133阳性细胞，并发现CD133阳性细胞具有TICs的基本特性。本实验中检测了胆囊癌GBC-SD细胞中CD133阳性细胞的侵袭能力，发现CD133阳性细胞的侵袭能力明显强于CD133阴性细胞。然而，解释TICs发动侵袭的机制有多种，因而，本研究重点在于探究胆囊癌GBC-SD细胞中CD133阳性细胞侵袭的发生机制。

SDF-1α/CXCR4轴是由趋化因子SDF-1α与其特异性受体CXCR4相互作用而构成的一个与细胞间信息传递及细胞迁移有密切关系的偶联分子对。研究^[10-12]发现，SDF-1α/CXCR4轴参与启动多种恶性肿瘤的侵袭和转移过程。另有文献^[13-14]报道，CXCR4高表达与胆囊癌淋巴结浸润和转移呈正相关，并可作为监测预后的独立因素。也有研究^[15]发现，SDF-1α/CXCR4轴在乳腺癌、前列腺癌、肺癌及胰腺癌的迁移、侵袭和转移过程中发挥关键作用。本实验从定位和定量的层面发现，胆囊癌GBC-SD细胞中CD133阳性细胞的CXCR4表达明显强于CD133阴性细胞；进一步研究SDF-1α刺激SDF-1α/CXCR4轴后，发现CD133阳性细胞的迁移和侵袭能力增强，而CD133阴性细胞无变化；AMD3100阻断SDF-1α/CXCR4轴后，CD133阳性细胞的迁移和侵袭能力下调，而CD133阴性细胞无变化。以上结果提示，胆囊癌GBC-SD细胞中CD133阳性细胞可能通过富集CXCR4以启动侵袭过程。

Ping等^[16]报道，SDF-1α/CXCR4轴可通过PI3K/Akt信号通路刺激神经胶质瘤干细胞CD133表达上调，进而促进血管生成。本课题组^[17]前期研究发现，在胃癌中，SDF-1α/CXCR4轴参与调控CD133的表达。本实验发现，SDF-1α或AMD3100分别处理GBC-SD细胞后，CD133 mRNA和蛋白水平表达分别上调或下调，由此推测，SDF-1α/CXCR4轴可能涉及调控胆囊癌GBC-SD细胞中CD133的表达，从而维持其TICs的基本特性。在结肠癌研究^[18]中发现，CXCR4和CD133联合表达呈现较强的转移能力。细胞分子生物学行为的调控往往是双向的、多点的、网状的。本实验发现，胆囊癌GBC-SD细胞中CD133阳性细胞富集CXCR4，而SDF-1α/CXCR4轴又调控CD133的表达，推测CD133与CXCR4可能是互为依存的双向调控关系。

ZONGSHANGSUOSHU，DANNANGAIGBC-SDXIBAOZHONGCD133YANGXINGXIBAODEQINXINENGLIDEHUODEKENENGSHITONGGUOFUJICXCR4FASHENGDE。XIANGHUDI，SDF-1α/CXCR4ZHOUYECANYUDIAOKONGCD133DEBIAODA。BENYANJIUJINYIBUCHANSHULEDANNANGAIGBC-SDXIBAOZHONGCD133YANGXINGXIBAOQINXIFASHENGJIZHI。RANER，GENGWEISHENRUDEFENZISHENGWUXUEJIZHIRENGSHANGYOUDAITANTAOYUYANJIU。